HL20023.7.1 通用型植物线粒体DNA萃取试剂盒 产品说明书（中文版） 主要用途 通用型植物线粒体DNA萃取试剂是一种旨在通过物理或化学破膜及离心处理方法，从植物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体细胞器，然后进一步生物酶处理以获得高质量的线粒体DNA的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。适合于各种新鲜植物组织，包括叶片（leaf）、谷粒（grain）、种子（seed）、以及培养细胞的线粒体核酸成分的分离。用于后续的杂交、克隆、酶切、PCR分析等。产品即到即用，操作简易，性能稳定，无核酶污染，萃取纯度和产量皆高。 技术背景 线粒体细胞器的研究是现代细胞生物学的zui重要的课题之一。线粒体成为生物衰老、古生物、细胞凋亡、能量代谢等研究的主要对象。线粒体DNA的分离和定量以及突变分析是研究中*的。 产品内容 清理液（Reagent A） | 200毫升 | 裂解液（Reagent B） | 80毫升 | 净化液（Reagent C） | 20毫升 | 强化液（Reagent D） | 10毫升 | 保存液（Reagent E） | 100毫升 | 破膜液（Reagent F） | 6毫升 | 去干扰液（Reagent G） | 600微升 | 酶解液（Reagent H） | 600微升 | 萃取液（Reagent I） | 6毫升 | 浓缩液（Reagent J） | 2毫升 | 助沉液（Reagent K） | 20微升 | 沉淀液（Reagent L） | 20毫升 | 纯化液（Reagent M） | 20毫升 | 冲液（Reagent N） | 1毫升 | 产品说明书 | 1份 |
保存方式 保存净化液（Reagent C）、去干扰液（Reagent G）、酶解液（Reagent H）、萃取液（Reagent I）和助沉液（Reagent K）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月 用户自备 15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备物的存放 50毫升锥形离心管：用于细胞或组织收集后离心或清洗 1.5毫升离心管：用于保存线粒体 4℃台式离心机：用于沉淀细胞 4℃超速离心机：用于分离细胞器成分 微型台式离心机：用于沉淀核酸 尼龙丝或60微米尼龙网：用于去除植物裂解残渣 小型漏斗：用于过滤的装置 DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞 58℃恒温水槽：用于孵育反应物 涡旋震荡仪：用于混匀 实验步骤 实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。 - 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量
- （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
- （选择步骤）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次
- 即刻用刀片切碎组织
- 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
- 加入预冷的5毫升裂解工作液
- 涡旋震荡5秒，充分混匀
- 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项7）
- （选择步骤）准备1个小型漏斗，内衬尼龙丝或60微米尼龙网，置于50毫升锥形离心管上
- （选择步骤）将所有组织匀浆液移入到小型漏斗里过滤（注意：可以使用4层纱布替代）
- 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管，放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
- 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
- 放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）
- 加入300微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中
- 涡旋震荡15秒，混匀颗粒群
- 转入1.5毫升离心管
- 置入冰槽中孵育15分钟
- 加入30微升去干扰液（Reagent G）
- 用200微升枪头上下抽吸混匀
- 放进37℃恒温水槽孵育15分钟
- 加入30微升酶解液（Reagent H）
- 涡旋震荡15秒
- 放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时
- 置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）
- 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前摇匀）
- 涡旋震荡5秒
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）
- 加入100微升浓缩液（Reagent J）到新的离心管
- 加入1微升助沉液（Reagent K）
- 加入800微升沉淀液（Reagent L）
- 在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀
- 放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）
- 小心抽掉上清液
- 加入1毫升纯化液（Reagent M）
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 空气中晾干沉淀颗粒群
- 加入20微升缓冲液（Reagent N）
- 溶解后放进－20℃冰箱保存或移出2微升进行PCR反应
实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。 - 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量
- （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
- （选择步骤）加入5毫升清理液（Reagent A）清洗1次
- 移入一个液氮冻存管
- 即刻放入液氮罐过夜
- 次日从液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
- 放进一个15毫升锥形离心管
- 加入预冷的5毫升裂解工作液
- 涡旋震荡5秒，充分混匀
- 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
- 加入预冷的500微升强化液（Reagent D）
- 涡旋震荡5秒，充分混匀
- 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项8）
- 加入预冷的5毫升保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
- （选择步骤）准备一个小型漏斗，内衬尼龙丝或60微米尼龙网，置于50毫升锥形离心管上
- （选择步骤）将所有组织匀浆液移入到小型漏斗里过滤（注：可以使用4层纱布替代）
- 放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
- 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
- 放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）
- 加入300微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中
- 涡旋震荡15秒，混匀颗粒群
- 转入1.5毫升离心管
- 置入冰槽中孵育15分钟
- 加入30微升去干扰液（Reagent G）
- 用200微升枪头上下抽吸混匀
- 放进37℃恒温水槽孵育15分钟
- 加入30微升酶解液（Reagent H）
- 涡旋震荡15秒
- 放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时
- 置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）
- 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前摇匀）
- 涡旋震荡5秒
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）
- 加入100微升浓缩液（Reagent J）到新的离心管
- 加入1微升助沉液（Reagent K）
- 加入800微升沉淀液（Reagent L）
- 在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀
- 放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）
- 小心抽掉上清液
- 加入1毫升纯化液（Reagent M）
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 空气中晾干沉淀颗粒群
- 加入20微升缓冲液（Reagent N）
- 溶解后放进－20℃冰箱保存或移出2微升进行PCR反应
实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。 - 准备5 X 107植物细胞或原生质体
- 移入一个50毫升锥形离心管
- 放入台式离心机离心10分钟，速度为200g
- 小心抽去上清液
- 加入5毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞
- 放入台式离心机离心10分钟，速度为300g
- 小心抽去上清液
- 加入预冷的5毫升裂解工作液
- 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
- 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约80下）（注意：参见注意事项7）
- 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管，放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
- 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
- 放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）
- 加入300微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中
- 涡旋震荡15秒，混匀颗粒群
- 转入1.5毫升离心管
- 置入冰槽中孵育15分钟
- 加入30微升去干扰液（Reagent G）
- 用200微升枪头上下抽吸混匀
- 放进37℃恒温水槽孵育15分钟
- 加入30微升酶解液（Reagent H）
- 涡旋震荡15秒
- 放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时
- 置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）
- 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前摇匀）
- 涡旋震荡5秒
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）
- 加入100微升浓缩液（Reagent J）到新的离心管
- 加入1微升助沉液（Reagent K）
- 加入800微升沉淀液（Reagent L）
- 在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀
- 放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）
- 小心抽掉上清液
- 加入1毫升纯化液（Reagent M）
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 空气中晾干沉淀颗粒群
- 加入20微升缓冲液（Reagent N）
- 溶解后放进－20℃冰箱保存或移出2微升进行PCR反应
实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。 - 准备5 X 107植物细胞或原生质体
- 移入一个50毫升锥形离心管
- 放入台式离心机离心10分钟，速度为200g
- 小心抽去上清液
- 加入5毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞
- 放入台式离心机离心10分钟，速度为300g
- 小心抽去上清液
- 加入预冷的5毫升裂解工作液
- 涡旋震荡5秒，充分混匀
- （选择步骤）超声波处理1分钟
- 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
- 加入预冷的500微升强化液（Reagent D）
- 涡旋震荡5秒，充分混匀
- 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项8）
- 加入预冷的5毫升保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
- 放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
- 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
- 放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）
- 加入300微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中
- 涡旋震荡15秒，混匀颗粒群
- 转入1.5毫升离心管
- 置入冰槽中孵育15分钟
- 加入30微升去干扰液（Reagent G）
- 用200微升枪头上下抽吸混匀
- 放进37℃恒温水槽孵育15分钟
- 加入30微升酶解液（Reagent H）
- 涡旋震荡15秒
- 放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时
- 置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）
- 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前摇匀）
- 涡旋震荡5秒
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）
- 加入100微升浓缩液（Reagent J）到新的离心管
- 加入1微升助沉液（Reagent K）
- 加入800微升沉淀液（Reagent L）
- 在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀
- 放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）
- 小心抽掉上清液
- 加入1毫升纯化液（Reagent M）
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 空气中晾干沉淀颗粒群
- 加入20微升缓冲液（Reagent N）
- 溶解后放进－20℃冰箱保存或移出2微升进行PCR反应
注意事项 - 本产品为2 0次操作（1克植物组织或5 X 107细胞）
- 线粒体操作均须在4℃或以下状态下进行
- 操作时，须无菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
- 建议使用足够的组织或细胞量
- 建议植物组织使用组织匀浆器操作；德国的BRAUN细胞匀浆器zui为理想
- 建议严格控制操作时间
- 通常匀化次数为80下（或细胞颗粒群/组织块状消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数。
- 通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
- 裂解液（Reagent B）具有吸附去除酚类物质的作用
- 不同组织，其线粒体含量不同；通常1克植物组织的线粒体含量为10至50微克线粒体蛋白
- 试剂中的溶液使用前摇匀；酶解液（Reagent H）需放进37℃冻温育许；为避免反复冻融，建议适量分装
- 通常1克植物组织或5 X 107细胞中提取的线粒体DNA达1至10微克
13． 本产品所获得的线粒体DNA纯度和产量zui为理想，确保无核DNA和外源性DNA污染 质量标准 - 本产品经鉴定性能稳定
- 本产品经鉴定无核酶污染
- 本产品经鉴定萃取产量和纯化程度高
- 本产品经鉴定无基因组DNA污染
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