植物叶片高质纯化叶绿体分离试剂盒

产品说明书

主要用途

植物叶片高质纯化叶绿体分离试剂是一种旨在通过物理破壁和化学破膜，以及差速和等密度离心处理方法，从植物叶片组织中分离出完整而高度纯化的活性叶绿体细胞器的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于菠菜、豌豆、莴苣、卷心菜、甜菜、烟草等各种新鲜植物叶片（leaf）组织，同时也适用于植物谷粒（grain）、种子（seed）等高纯叶绿体成分的分离。用于高等植物不育性、叶绿体功能和活性、遗传等研究。 产品即到即用，操作简易，性能稳定，无核酶和蛋白酶污染，萃取纯度和产量皆高。 

技术背景

叶绿体（chloroplast）是绿色植物进行光合作用和能量转化的重要细胞器。叶绿体是细胞质中的一种色素体，因含叶绿素而成绿色。叶绿体由外被（envelope）、类囊体（thylakoid）和基质（stroma）组成。叶绿体DNA是一种闭合环状双股结构，含有10至30个基因，编码200个蛋白质。  

产品内容

保存方式

保存净化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于保存叶绿体样品

尼龙丝或60微米尼龙网：用于去除植物裂解残渣

小型漏斗：用于过滤的装置

（微型）台式离心机：用于样品操作

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞

涡旋震荡仪：用于混匀

实验步骤

• 物理匀浆法

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）冻融，然后移取xx微升活性液（Reagent D）、 xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。

• 准备好新鲜的植物叶片组织，并秤重以确定1克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 用刀片切碎组织（注意：建议去除叶茎）
• 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
• 加入预冷的xx毫升裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
• 置于冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项9）
• （选择步骤）准备1个小型漏斗，内衬尼龙丝或60微米尼龙网，置于50毫升锥形离心管上
• （选择步骤）将所有组织匀浆液移入到小型漏斗里过滤（注意：可以使用4层纱布替代）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为200g
• 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果跳过过滤步骤或上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为200g）——此步骤去除细胞壁残渣、细胞核和未溶解的细胞 

• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液，保留绿色沉淀颗粒，避免光照——此步骤获得叶绿体沉淀物
• 加入xx毫升保存液（Reagent F），混匀颗粒群
• 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
• 移取xx毫升的高纯液（Reagent G）到15毫升锥形离心管
• 小心沿着管壁，在高纯液（Reagent G）上面，一滴一滴加入xx毫升分层液（Reagent H）（注意：避免晃动）
• 小心沿着管壁，在分层液（Reagent H）上面，一滴一滴加入3毫升上述获得的叶绿体组分 （注意：避免晃动）
• 小心放进4℃台式离心机离心30分钟，速度为2500g
• 小心取出离心管（注意：避免晃动）：可见中间交界处（8厘米处）绿色样品带 
• 小心抽去叶绿体样品带以上的液体
• 小心收集叶绿体样品带到2毫升离心管——此步骤获得高纯叶绿体样品带
• 放进微型台式离心机离心15分钟，速度为1500g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent F），充分混匀沉淀颗粒群
• （选择步骤）进行叶绿素定量测定（建议使用植物叶绿体总蛋白定量检测试剂盒）
• 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里保存

• 化学处理法

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）冻融，然后移取xx微升活性液（Reagent D）、 xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。

• 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定1克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入预冷的xx毫升裂解工作液
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
• 加入预冷的xx微升强化液（Reagent E）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项10）
• 加入预冷的xx毫升保存液（Reagent F），轻轻摇动试管混匀
• （选择步骤）准备1个小型漏斗，内衬尼龙丝或60微米尼龙网，置于50毫升锥形离心管上
• （选择步骤）将所有组织裂解液移入到小型漏斗里过滤（注意：可以使用4层纱布替代）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为200g
• 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果如果跳过过滤步骤或上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为200g）——此步骤去除细胞壁残渣、细胞核和未溶解的细胞
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
• 小心抽去上清液，保留绿色沉淀颗粒，避免光照——此步骤获得叶绿体沉淀物

• 加入xx毫升保存液（Reagent F），混匀颗粒群
• 放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作
• 移取xx毫升的高纯液（Reagent G）到15毫升锥形离心管
• 小心沿着管壁，在高纯液（Reagent G）上面，一滴一滴加入xx毫升分层液（Reagent H）（注意：避免晃动）
• 小心沿着管壁，在分层液（Reagent H）上面，一滴一滴加入3毫升上述获得的叶绿体组分 （注意：避免晃动）
• 小心放进4℃台式离心机离心30分钟，速度为2500g
• 小心取出离心管（注意：避免晃动）：可见中间交界处（8厘米处）绿色样品带 
• 小心抽去叶绿体样品带以上的液体
• 小心收集叶绿体样品带到2毫升离心管——此步骤获得高纯叶绿体样品带
• 放进微型台式离心机离心15分钟，速度为1500g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent F），充分混匀沉淀颗粒群
• （选择步骤）进行叶绿素定量测定（建议使用植物叶绿体总蛋白定量检测试剂盒）
• 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里保存

注意事项

• 本产品为10次操作（1克植物叶片组织/次）
• 建议使用新鲜植物样品，暗室4℃冰箱里过夜
• 植物样品务必避光，以防止淀粉聚集
• 叶绿体操作均须在4℃或以下状态下进行
• 操作时，须无菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）、保存液（Reagent F）、高纯液（Reagent G）和分离液（Reagent H）
• 建议使用足够的组织量
• 建议植物组织使用物理法组织匀浆器操作为；德国的BRAUN细胞匀浆器zui为理想
• 建议严格控制操作时间
• 通常匀化次数为80下（或组织块状消失为止）达到80％的组织细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的组织细胞裂解程度：完整组织细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
• 通常孵育5分钟达到80％的组织细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的组织细胞裂解程度：完整组织细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
• 本公司提供系列植物叶绿体分析技术产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定分离的叶绿体内外膜完整
• 本产品经鉴定分离的叶绿体维持正常活性
• 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶