植物细胞内氧化应激活性氧超氧阴离子红色荧光测定试剂盒

产品说明书

主要用途

植物细胞内氧化应激活性氧超氧阴离子红色荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂二氢溴化乙啶，在细胞氧化条件下，产生红色荧光，来检测细胞内超氧阴离子活性氧族的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种其适用于新鲜植物组织（例如根尖、叶片等）和培养细胞等细胞内氧化应激活性氧的分析。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老和代谢等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定，滞留持久，荧光清晰。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。二氢溴化乙啶（Dihydroethidium bromide；Hydroethidine；DHE）是一种*自由通过细胞膜，并在细胞内滞留而不外漏的染色剂。一旦被超氧自由基阴离子氧化，二氢溴化乙啶转化为溴化乙啶，进入细胞核，与DNA紧密结合，便产生荧光。据此证明细胞内超氧阴离子活性氧族的存在。

产品内容

保存方式

保存染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；固着液（Reagent B）和离析液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于细胞脱离

*细胞培养液：用于细胞操作所需的培养基

15毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器

1.5毫升离心管：用于染色液配制的容器

载玻片：用于组织染色操作

解剖针：用于植物组织解剖

血细胞计数仪：用于细胞计数

（微型）台式离心机：用于样品处理

培养箱：用于染色孵育

比色皿或酶标板：用于荧光定量分析的容器

（共聚焦）荧光显微镜：用于荧光分析

细胞流式仪：用于用于细胞染色分析

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析

实验步骤

方法一：活体组织染色

• 加上xx微升清理液（Reagent A）在载玻片上
• 切取新鲜植物根尖，放进载玻片上的清理液（Reagent A）中
• 用解剖针小心压碎根尖
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上xx微升染色液（Reagent D） 
• 放进37℃培养箱里孵育20分钟
• 取出载玻片，移去染色液
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 盖上盖玻片，用拇指小心且垂直加压
• 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长540nm，散发波长590nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高

方法二：组织固定染色

• 加上xx微升清理液（Reagent A）在载玻片上
• 切取新鲜植物根尖，放进载玻片上的清理液（Reagent A）中
• 用解剖针小心压碎根尖
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升固着液（Reagent B）
• 室温下，孵育3小时，避免干化
• 小心移去固着液（Reagent B）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升离析液（Reagent C）
• 室温下孵育5分钟
• 小心移去离析液（Reagent C）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）

• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上xx微升染色液（Reagent D） 
• 放进37℃培养箱里孵育20分钟
• 取出载玻片，移去染色液
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 盖上盖玻片，用拇指小心且垂直加压
• 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长540nm，散发波长590nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高

方法三、培养植物细胞脱离染色

• 准备1瓶25cm²细胞培养瓶的待测细胞
• 小心抽去细胞培养液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面
• 置入37℃培养箱1分种
• 振动培养瓶，使细胞脱落
• 加入4毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入15毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞直接从这一步骤开始）
• 移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数
• 移出1 X 10⁶细胞到新的15毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A）
• 再加入xx微升染色液（Reagent D），混匀
• 放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的xx微升清理液（Reagent A），轻柔混匀细胞颗粒群
• 放进冰槽里
• 选择下列方式之一进行操作：
  • 即刻进行细胞流式仪分析：藻红蛋白（phycoerythrin；PE）波段，观察50000个细胞以上――

波峰右移，表明超氧阴离子含量高

• 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片

2）激发波长540nm，散发波长590nm――

红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高

• 或使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

1）移取400微升上述细胞悬液到1毫升比色皿

2）加入xx微升清理液（Reagent A）

3）上下倾倒混匀数次

4）放进荧光分光光度仪：激发波长540nm，散发波长590nm――

RFU增高，表明超氧阴离子含量高

方法四、贴壁培养细胞染色

• 准备1个细胞培养24孔板的待测细胞，细胞铺满率达70％

（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项4）

• 小心抽去细胞培养液
• 小心沿着孔壁加入xx微升清理液（Reagent A）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面
• 再加入xx微升染色液（Reagent D）
• 放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟
• 小心抽去染色液 
• 小心沿着孔壁加入xx微升37℃预热的清理液（Reagent A）到细胞培养孔
• 选择下列方式之一进行操作：

（A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）：

激发波长540nm，散发波长590nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高

• 使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪：激发波长540nm，散发波长590nm――RFU增高，表明超氧阴离子含量高

注意事项

• 本产品为20次操作
• 操作时，须戴手套
• 固着液（Reagent B）和离析液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全
• 孵育时，必须避免光照
• 建议染色完成后，即刻进行荧光检测分析
• 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整操作用量：

• 本产品适合活体染色和固定染色，染色剂不易洗掉，染色持久
• 根据不同组织类型，调整染色液（Reagent D）的使用剂量（1：100至1：1000容量比），避免过度染色
• 本公司提供系列活性氧分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰