动物细胞/组织线粒体粗提分离试剂盒
产品说明书
主要用途
动物细胞/组织线粒体粗提分离试剂是一种旨在从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体细胞器的
而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于动物软组织（肝或脑组织）和培
养细胞的线粒体的制备。其制备物产量高，可以被用于细胞凋亡、信号传递、能量代谢、蛋白组学和病理
生理学等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度堪称同类产品zui
佳。
技术背景
线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的zui常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方
法基本上采用：*，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞
器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
净化液（Reagent C） 毫升
强化液（Reagent D） 毫升
保存液（Reagent E） 毫升
说明书1 份
保存方式
保存净化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6 月
用户自备
HANK 平衡盐缓冲溶液或PBS 缓冲溶液：用于清理细胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于细胞脱离
*细胞培养液：用于细胞处理所需的培养基
15 毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备物的存放
50 毫升锥形离心管：用于细胞或组织收集后离心或清洗
1.5 毫升离心管：用于保存线粒体
4℃台式离心机：用于沉淀细胞
4℃超速离心机：用于分离细胞器成分
DOUNCE 匀浆器：用于裂解细胞
实验步骤
2
一、动物软组织线粒体分离（组织匀浆法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出xx 毫升净化液（Reagent C）和
xx 毫升的裂解液（Reagent B）到15 毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。
然后进行下列操作。
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定1 克组织重量（实验前使动物空腹12 至24 小时）
2． （选择步骤）放进预冷的50 毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入xx 毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 即刻用刀片切碎组织
5． 放进一个预冷的15 毫升锥形离心管
6． 加入xx 毫升预冷的裂解工作液
7． 涡旋震荡5 秒，充分混匀
8． 即刻放入预冷的DOUNCE 匀浆器
9． 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20 至40 下）（注意：参见注意事项8）
10．将所有组织匀浆物移入15 毫升锥形离心管
11．放进4℃台式离心机离心10 分钟，速度为1500g
12．小心移出上清液到另一个新的预冷的15 毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
13．放进4℃超速离心机离心10 分钟，速度为10000g
14．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
（注意：如果进行线粒体DNA 萃取，直接进入线粒体DNA 萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
15．（选择步骤）加入xx 毫升预冷的保存液（Reagent E）
16．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5 分钟，速度为10000g
17．（选择步骤）小心抽去上清液
18．加入xx 毫升保存液（Reagent E），充分混匀
19．即刻移入1.5 毫升离心管，放进－70℃冰箱里
二、动物软组织线粒体分离（化学处理法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出xx 毫升净化液（Reagent C）和
xx 毫升的裂解液（Reagent B）到15 毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。
然后进行下列操作。
1． 手术取出动物组织，并秤重以确定1 克组织重量（实验前使动物空腹12 至24 小时）
2． （选择步骤）放进预冷的50 毫升锥形离心管
3． （选择步骤）加入xx 毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 移入一个液氮冻存管
5． 即刻放入液氮罐过夜
6． 次日从液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
7． 放进一个15 毫升锥形离心管
8． 加入xx 毫升预冷的裂解工作液
9． 涡旋震荡5 秒，充分混匀
10．在冰槽里孵育2 分钟，期间涡旋震荡5 秒一次
3
11．加入xx 微升预冷的强化液（Reagent D）
12．涡旋震荡5 秒，充分混匀
13．在冰槽里孵育5 分钟，期间涡旋震荡5 秒二次（注意：参见注意事项9）
14．加入xx 毫升预冷的保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
15．放进4℃台式离心机离心10 分钟，速度为1500g
16．小心移出上清液到另一个新的预冷的15 毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
17．放进4℃超速离心机离心10 分钟，速度为10000g
18．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
（注意：如果进行线粒体DNA 萃取，直接进入线粒体DNA 萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
19．（选择步骤）加入xx 毫升预冷的保存液（Reagent E）
20．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5 分钟，速度为10000g
21．（选择步骤）小心抽去上清液
22．加入xx 毫升保存液（Reagent E），充分混匀
23．即刻移入1.5 毫升离心管，放进－70℃冰箱里
三、动物细胞线粒体分离（细胞匀浆法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出xx 毫升净化液（Reagent C）和
xx 毫升的裂解液（Reagent B）到15 毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。
然后进行下列操作。
1． 准备5 至10 瓶75cm2 细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
2． 分别加入10 毫升用户自备的HANK 平衡盐缓冲溶液或PBS 缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶
表面，然后抽去
3． 重复实验步骤2 一次
4． 加入3 毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
5． 置入37℃培养箱3 分种
6． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，
7． 分别加入10 毫升用户自备的*细胞培养液
8． 移入一个50 毫升锥形离心管
9． 放进台式离心机离心10 分钟，速度为200g
10．小心抽去上清液
11．加入xx 毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞
12．放进台式离心机离心10 分钟，速度为300g
13．小心抽去上清液
14．加入xx 毫升预冷的裂解工作液
15．涡旋震荡5 秒，充分混匀细胞颗粒群
16．即刻放进预冷的DOUNCE 匀浆器
17．在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20 至40 下）（注意：参见注意事项8）
18．将所有细胞匀浆物移入15 毫升锥形离心管
19．放进4℃台式离心机离心10 分钟，速度为1500g
20．小心移出上清液到另一个新的预冷的15 毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
21．放进4℃超速离心机离心10 分钟，速度为10000g
22．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
4
（注意：如果进行线粒体DNA 萃取，直接进入线粒体DNA 萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
23．（选择步骤）加入xx 毫升预冷的保存液（Reagent E）
24．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5 分钟，速度为10000g
25．（选择步骤）小心抽去上清液
26．加入xx 毫升保存液（Reagent E），充分混匀
27．即刻移入1.5 毫升离心管，放进－70℃冰箱里
四、动物细胞线粒体分离（化学处理法）
实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出xx 毫升净化液（Reagent C）和
xx 毫升的裂解液（Reagent B）到15 毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。
然后进行下列操作。
1． 准备5 至10 瓶75cm2 细胞培养瓶的细胞（5 X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面
2． 分别加入10 毫升用户自备的HANK 平衡盐缓冲溶液或PBS 缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶
表面，然后抽去
3． 重复实验步骤2 一次
4． 加入3 毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
5． 置入37℃培养箱3 分种
6． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落
7． 分别加入10 毫升用户自备的*细胞培养液
8． 移入一个50 毫升锥形离心管
9． 放进台式离心机离心10 分钟，速度为200g
10．小心抽去上清液
11．加入xx 毫升预冷的清理液（Reagent A）
12．放进台式离心机离心10 分钟，速度为300g
13．小心抽去上清液
14．加入xx 毫升预冷的裂解工作液
15．涡旋震荡5 秒，充分混匀
16．在冰槽里孵育2 分钟，期间涡旋震荡5 秒一次
17．加入xx 微升预冷的强化液（Reagent D）
18．涡旋震荡5 秒，充分混匀
19．在冰槽里孵育5 分钟，期间涡旋震荡5 秒二次（注意：参见注意事项9）
20．加入xx 毫升预冷的保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
21．放进4℃台式离心机离心10 分钟，速度为1500g
22．小心移出上清液到另一个新的预冷的15 毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
23．放进4℃超速离心机离心10 分钟，速度为10000g
24．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
（注意：如果进行线粒体DNA 萃取，直接进入线粒体DNA 萃取试剂盒的步骤4，继续下去）
25．（选择步骤）加入xx 毫升预冷的保存液（Reagent E）
26．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心5 分钟，速度为10000g
27．（选择步骤）小心抽去上清液
28．加入xx 毫升保存液（Reagent E），充分混匀
29．即刻移入1.5 毫升离心管，放进－70℃冰箱里
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注意事项
1． 本产品为10 次（1 克动物组织或5 X 107 细胞）或50 次（200 毫克动物组织或1 X 107 细胞）操作
2． 实际操作的动物组织重量或细胞量与试剂使用量按比例调整：例如200 毫克动物组织：试剂用量是标
准用量的五分之一
3． 所有操作均须严格在4℃或以下状态进行
4． 操作时，须戴手套
5． 操作时，须无菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
6． 建议使用足够的样品量
7． 建议严格控制操作时间
8． 通常匀化次数为20 至40 下（或细胞颗粒群/组织块状消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但
不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3 微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细
胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
9． 通常孵育5 分钟（不宜超过5 分钟）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存
在差异。用户可以通过显微镜观察3 微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50
％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
10．对于难以裂解的细胞，例如HeLa 细胞，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理
11．通常1 克动物组织或5 X 107 细胞的线粒体含量为50 微克以上线粒体蛋白
12．如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解
13．本产品所获得的线粒体纯度和产量zui为理想。通过调整10000g离心速度到3000至8000g，可以提高粗提
的线粒体纯化程度，但线粒体产量相应减少
14．如果需要获得99％以上纯度的线粒体，使用动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒
15．线粒体正常活性测定方法是： CITRATE SYNTHASE 活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等
16．线粒体内外膜完整测定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE 活性和荧光JC 染色
17．本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等
18．本公司提供系列线粒体分析试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定分离的线粒体内外膜完整
3． 本产品经鉴定分离的线粒体维持正常活性
4． 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶