超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒产品说明书 主要用途 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase；SOD）活性检测试剂是一种旨在通过比色测定高度可溶性的四唑盐在超氧化物阴离子的还原作用下产生的水溶性甲臢染料，来定量分析氧化酶的还原效率，由此检测超氧化物岐化酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞和组织，包括红细胞或线粒体中超氧化物歧化酶的活性检测以及50%活性抑制率（IC50）。广泛运用于医药研究、生化分析、植物生理、食品工程等方面。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 超氧化物岐化酶（SOD），是体内的重要金属酶抗氧化剂，催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢（H2O2）和分子氧（O2），破坏自由基，防止氧毒性。SOD浓度的变化与许多疾病密切相关。检测超氧化物岐化酶活性的方法包括氮蓝四唑（nitroblue tetrazolium；NBT）法，使用和氧化酶来控制超氧化物的生成并检测超氧自由基的NBT的比率，其敏感度较高。但是NBT的还原终产物双甲臢染料水溶性差，易和还原的氧化酶相互作用。还原法通过还原后的生成紫色的染料，来检测超氧自由基。但是还原后的的吸收峰过窄而敏感性差，并且受到与反应的细胞提取物，例如NADPH还原酶或其他的还原剂干扰，造成背景噪音高，而无法测定低水平的SOD活性。 超氧化物歧化酶活性检测试剂使用高度水溶性的四唑盐:WST-1[（2-（4-Iodophenyl）-3- （4-nitrophenyl）-5-（2,4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium，monosodium salt）；2-(4–碘苯基)-3-（4–硝基苯基）-5-（2,4-苯二磺酸）-2H-四唑单钠盐]。WST-1灵敏度高，氧化态的吸光度低，呈浅黄色，水溶性好，可以100%被SOD抑制，检测不受pH影响，背景噪音低。WST-1被O2－还原（呈现深黄色）的还原率和氧化酶的活性成线性关系，该反应能被超氧化物岐化酶（SOD）抑制（抑制，WST-1呈现无色）。利用SOD能抑制WST-1和O2－的氧化还原能力来测定SOD的活性（波长为450nm的比色分析）。 产品内容 反应液（Reagent A） 15毫升 染色液（Reagent B） 75微升 催化液（Reagent C） 40微升 稀释液（Reagent D） 2毫升 补充液（Reagent E） 1.5毫升 标准液（Reagent F） 100微升 产品说明书 1份 保存方式 保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent B），避免光照，有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于反应液配制的容器 15毫升锥形离心管：用于反应液配制的容器 酶标板或比色皿：用于比色分析的容器 酶标仪或分光光度仪：用于比色分析 实验步骤 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置入冰槽里融化，然后移出4毫升反应液（Reagent A）到新的15毫升锥形离心管，加入20微升染色液（Reagent B），轻柔混匀后，置于暗室里，标记为染色工作液。然后移出400微升稀释液（Reagent D）到新的1.5毫升离心管，加入10微升催化液（Reagent C），轻柔混匀后，置于冰槽里，标记为催化工作液。然后进行下列操作。 一、 标准样品制备 1. 取出待测的标准液（Reagent F），置于冰槽里 2. 准备1个96孔酶标板，做好1至5号标记，置于冰槽里 3. 按下列顺序依次加入下列反应液到96孔板的标记孔里： 1） 分别移取20微升稀释液（Reagent D）到96孔板的2至5号孔里 2） 移取40微升标准液（Reagent F）到96孔板的1号孔里 3） 用200微升枪头抽去20微升1号孔里的标准液（Reagent F）到96孔板的2号孔里 4） 用200微升枪头上下抽吸混匀2号孔 5） 用200微升枪头抽去20微升2号孔里含有标准液（Reagent F）的稀释液到96孔板的3号孔里 6） 用200微升枪头上下抽吸混匀3号孔 7） 用200微升枪头抽去20微升3号孔里含有标准液（Reagent F）的稀释液到96孔板的4号孔里 8） 用200微升枪头抽去20微升4号孔里含有标准液（Reagent F）的稀释液，扔掉 9） SOD实际浓度见下表 管号 | 稀释液（Reagent D） | 标准液（Reagent F） | SOD浓度 （单位/毫升） | 1 | 0微升 | 40微升 | 12 | 2 | 20微升 | 20微升1号管 | 6 | 3 | 20微升 | 20微升2号管 | 3 | 4 | 20微升 | 20微升3号管 | 1.5 | 5 | 20微升 | 0 | 0 |
二、 样品测定 1． 准备好待测的样品（例如细胞或组织匀浆上清液包括红细胞以及胞浆SOD样品或线粒体SOD样品等）和上述制备的标准样品，置于冰槽里 2． 设定好酶标仪并预热：波长450nm 3． 准备好1个96孔板，做好相应标记：样品背景、零活性对照、活性对照、待测样品和标准样品 4． 按下表依次加入下列试剂到96孔板的相应孔里： A． 分别移取200微升含有反应液（Reagent A）和染色液（Reagent B）的染色工作液到96孔板的所有孔里 B． 然后分别移取20微升含有催化液（Reagent C）和稀释液（Reagent D）的催化工作液到96孔板的相应孔里 C． 继续分别移取20微升稀释液（Reagent D） 到96孔板的相应孔里 D． 继续分别移取20微升补充液（Reagent E） 到96孔板的相应孔里 E． 移取20微升待测样品到96孔板的相应孔里（注意：参见注意事项6） F． 最后分别移取上述制备的20微升不同浓度的标准液（Reagent F）到96孔板的相应孔里 内容物 | 样本背景 | 空对照（零活性） | 活性对照 | 待测样品 | 标准样品 | 染色工作液 | 200微升 | 200微升 | 200微升 | 200微升 | 200微升 | 催化工作液 | ―― | ―― | 20微升 | 20微升 | 20微升 | 稀释液（Reagent D） | 20微升 | 20微升 | ―― | ―― | ―― | 补充液（Reagent E） | ―― | 20微升 | 20微升 | ―― | ―― | 待测样品 | 20微升 | ―― | ―― | 20微升 | ―― | 标准液（Reagent F） | ―― | ―― | ―― | ―― | 20微升 | 96孔板每孔总量 | 背景孔 （240微升） | 空对照孔 （240微升） | 活性孔（240微升） | 样品孔 （240微升） | 标准样品孔 （240微升） |
5． 轻轻摇动96孔板，混匀反应液 6． 放进37℃培养箱孵育20分钟，避免光照 7． 即刻放进酶标仪检测，波长为450nm 8． 计算样品SOD活性（SOD活性＝XO即氧化酶抑制百分率）： 1）[（活性读数－零活性读数）－（样品活性读数－样本背景读数）]÷（活性读数－零活性 读数）＝实际抑制百分率 2）IC50：50％抑制率所需的样品SOD或样品含有SOD蛋白浓度（毫克/毫升） X（所需样品蛋白浓度）＝（已知样品蛋白浓度÷实际抑制百分率）X 50％ 3）样品SOD实际活性单位计算： A． 构建SOD标准曲线：横座标（x轴）为每毫升SOD单位浓度；纵坐标（y轴）为标准样品读数（吸光单位OD值） B． 根据SOD标准曲线，测算样品中含有SOD或SOD类物质的活性单位（单位/毫克样品） C． 根据样品50％抑制百分率，找到对应SOD活性单位（单位/毫克样品） 注意事项 1． 本产品为50次操作 2． 操作时，须戴手套 3． 操作时，须在4℃下进行 4． 染色液（Reagent B）为浅黄色，如果有结晶析出，放进37℃温育数分钟即可。染色液（Reagent B）一旦被还原，呈现可见黄色或深黄色；如果含有SOD，则会呈现为无色 5． 每增加10个样品，增加染色工作液为：反应液（Reagent B）2毫升＋染色液（Reagent B）10微升，和催化工作液为：稀释液（Reagent D）200微升＋催化液（Reagent C）5微升，以此类推。配制工作液时，须根据样本数量配制实际工作液容量 6． 待测样品总量通常为20至200微克的细胞裂解悬液或2至20微克线粒体裂解悬液 7． 测定20个以上样品，建议使用排枪操作，以减少样品操作时间上的延长导致超氧化物（superoxide）的释放而干扰精确测定 8． 孵育时，避免光照 9． 孵育后即刻比色测定 10． 建议每个样品检测重复3次 11． 0.1毫摩尔抗坏血酸（Ascorbic acid）、5毫摩尔还原型（Glutathione）和牛血清白蛋白会增加背景读数，干扰样品测定，但不影响实际活性检测（已有背景读数调整） 12． 样品SOD实际活性单位定义：每毫克样品蛋白含有X微克或X单位SOD量 13． 标准液（Reagent F）的活性单位定义为25℃温度，pH7.8的条件下，抑制50%在氧化酶参与的反应系统中，WST-1和O2－之间的氧化还原能力 14． 本公司提供系列超氧化物歧化酶分析试剂产品 质量标准 1． 本产品经鉴定性能稳定 2． 本产品经鉴定检测敏感
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