细胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书 主要用途 细胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物，受到CDK1/CYCLIN B磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后峰值的变化，以分析细胞裂解样品中CDK1/CYCLIN B特异活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或纯化酶样品中CDK1/CYCLIN B激酶的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。 技术背景 细胞周期素依赖性激酶1（cyclin dependent kinase 1；CDK1），又称为细胞分裂周期蛋白2（cell division cycle2；CDC2）或p34cdk1，属于激酶（serine/threonine protein kinase）家属成员之一。其为高度进化保留的激酶复合物，成熟促进因子（maturation promoting factor；MRF）中的催化亚体，含有297氨基酸，与细胞周期素B结合，允许细胞由G2期进入有丝分裂期以及由G1期进入DNA合成期，达到调节细胞生长、DNA复制、细胞分裂等。其磷酸化目标序列为 GGGRSPGRRRRK。基于底物GGGRSPGRRRRK，在ATP的存在下，受到CDK1/CYCLIN B激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析细胞周期素依赖性激酶1/细胞周期素B的特异活性。其反应方式为： 产品内容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 缓冲液（Reagent C） 毫升 酶促液（Reagent D） 微升 反应液（Reagent E） 微升 底物液（Reagent F） 微升 阴性液（Reagent G） 微升 产品说明书 1份 保存方式 保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月 用户自备 CDK1/CYCLIN B激酶：用于抑制剂筛选 1.5毫升离心管：用于样品保存的容器 15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器 细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离 （微型）台式离心机：用于细胞预处理 100微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器 分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析 实验步骤 一、 待测样品准备 1． 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞） 2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面 3． 小心抽去清理液 4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用消化） 5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞 6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始） 7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g 8． 小心抽去上清液 9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀 10． 转移到预冷的1.5毫升离心管 11． 强力涡旋震荡15秒 12． 置于冰槽里孵育30分钟 13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1） 16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 二、 测定准备 1． 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里 2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零 三、 背景对照测定 1． 移取65微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入10微升酶促液（Reagent D） 3． 加入10微升反应液（Reagent E） 4． 加入10微升底物液（Reagent F） 5． 放进30℃培养箱里静置3分钟 6． 加入5微升阴性液（Reagent G） 7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内） 8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟 四、 样品测定 1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 2． 加入xx微升酶促液（Reagent D） 3． 加入xx微升反应液（Reagent E） 4． 加入xx微升底物液（Reagent F） 5． 放进30℃培养箱里静置3分钟 6． 加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解） 7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内） 8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟 |
