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细胞基质金属蛋白酶 3 活性比色法定量检测试剂盒
点击次数:350 更新时间:2023-07-03

主要用途

细胞基质金属蛋白酶 3(MMP-3)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过含硫多肽底物以及特定抑制剂

存在与否的情况下,受到 MMP3 的水解,释放出巯基,进而使用 Ellman 试剂,产生黄色 5-巯基-2-硝基苯

甲酸产物吸光峰值的变化,即采用比色法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术

经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或纯化酶样

品中基质金属蛋白酶 3 的特异活性定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操

作简捷,性能稳定,安全可靠。 技术背景

基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases;MMPs)是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的

总称,因含有金属(锌、钙)离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少

有28种,几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质(extracellular matrix)成分,同时参与胚胎发育、形态

形成、胚泡植入(blastocyst)、血管形成、组织再吸收(tissue resorption)、疾病发生,例如关节炎、癌细胞

浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类:(1)胶原酶:MMP1、MMP8、MMP13主要消化

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖;(2)明胶酶(Ⅳ型胶原酶):MMP2、MMP9,又称明胶酶A、B,

主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维;(3)基质溶解素:MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12,

主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9;

(4)膜型金属蛋白酶:MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP,主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内

绝大多数细胞并不储备MMPs,当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成,合成的MMPs以无活性的酶

原(proenzyme)形式分泌到细胞外,随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活,一种激活的MMPs 可激活另一种MMPs,形成瀑布效应。基质金属蛋白酶-3(EC3.4.24.17),又称基质裂解素1(stromelysin-1)、

转换素1(transin-1)或蛋白多糖酶(proteoglycanase),是糖基化细胞外基质蛋白酶,其前体分子量为55至

59kDa,激活后分子量为21至48kDa。它在血清或细胞上清中浓度通常为10至200纳克/毫升。它的作用目标

是胶原蛋白III、IV、V、IX(collagens)、纤维连接蛋白(fibronectin)、弹性纤维蛋白(elastin)、层粘连

蛋白 (laminin)、纤溶酶原(plasminogen)、HB-EGF、E-钙粘附蛋白(E-cadherin)、其它MMP(2、7、

8、9、13)、TIMP2、IL-1β、MBP、明胶、蛋白聚糖(aggrecan)、串珠素(perlecan)、核心蛋白聚糖(decorin)、

骨粘连蛋白(osteonectin)、卵白抑制素(ovostatin)、entactin等。基质金属蛋白酶-3降解各种细胞外基质

成分,并作为类(serpin type)蛋白酶抑制剂。与肿瘤促发、结缔组织重塑(remodeling)、伤口修复、

动脉粥样硬化进展等疾病有关。基于含硫多肽(thiopeptide)底物Ac-PLG(2-mercapto-4-methyl-pentanoyl)

-LG-OC2H5,在特异性抑制剂UK356618存在与否的条件下,受到MMP3的水解,释放出巯基(sulfhydryl

group),进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)[5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid);DTNB]反

应后,产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸(5-thio-2-nitrobenzoic acid;TNB),通过其吸收峰值的变化(412nm 波长),来定量测定细胞基质金属蛋白酶3的特异活性。基质金属蛋白酶3反应系统为: 产品内容

清理液(Reagent A) 毫升

裂解液(Reagent B) 毫升

2

缓冲液(Reagent C) 毫升

反应液(Reagent D) 毫升

底物液(Reagent E) 微升

阴性液(Reagent F) 微升

专性液(Reagent G) 微升

产品说明书 1 份

保存方式

保存反应液(Reagent D)和底物液(Reagent E)、专性液(Reagent G)在-20℃冰箱里;缓冲液(Reagent

C)保存在室温下;其余的保存在 4℃冰箱里;反应液(Reagent D)、底物液(Reagent E)和专性液(Reagent

G)避免光照;有效保证 3 月

用户自备

1.5 毫升离心管:用于反应液配制的容器

15 毫升锥形离心管:用于样品制备的容器

细胞刮脱棒:用于脱离贴壁细胞

(微型)台式离心机:用于样品制备

培养箱:用于反应孵育

200 微升 1 厘米光径比色皿或 96 孔板:用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

实验步骤

一、 样品准备

1. 准备好 75cm2细胞培养瓶或 100mm 细胞培养皿的待测培养细胞(1 至 5 X 10

7细胞)

2. 小心加入 xx 毫升清理液(Reagent A),覆盖生长表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:避免使用消化)

5. 加入 xx 毫升清理液(Reagent A),混匀细胞

6. 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)

7. 放进 4℃台式离心机离心 5 分钟,速度为 300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入 xx 微升裂解液(Reagent B),充分混匀

10.转移到预冷的 1.5 毫升离心管

11.强力涡旋震荡 15 秒

12.置于冰槽里孵育 30 分钟

13.放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟,速度为 16000g(或 13000RPM,例如 eppendorf 5415)

14.小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管

15.移取 10 微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 BCA 蛋白质浓度定量试剂盒-30031.1)

16.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

3

二、 测定准备

1. 开启并设定好分光光度仪(温度为 37℃):波长 412nm,间隔 1 分钟,读数 15 次(共 15 分钟),并置

2. 从-20℃冰箱里取出试剂,置于冰槽里融化;反应液(Reagent D)和底物液(Reagent E)避免光照

3. 缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度

三、 (选择步骤)样品背景对照测定

1. 移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2. 加入 xx 微升反应液(Reagent D)

3. 加入 xx 微升阴性液(Reagent F)

4. 上下倾倒数次,混匀

5. 在 37℃温度下孵育 3 分钟

6. 加入 10 微升待测样品(100 微克总蛋白)(注意:样品须清澈)

7. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)

8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(15 分钟读数-0 分钟读数)

四、 样品总活性测定

1. 移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2. 加入 xx 微升反应液(Reagent D)

3. 加入 xx 微升底物液(Reagent E)

4. 上下倾倒数次,混匀

5. 在 37℃温度下孵育 3 分钟

6. 加入 10 微升待测样品(100 微克总蛋白)(注意:样品须清澈)

7. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)

8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(15 分钟读数-0 分钟读数)

五、样品非特异活性测定

检测开始前,移取 10 微升待测样品(100 微克总蛋白)到新的 1.5 毫升离心管,加入 xx 微升专性液(Reagent

G),混匀后,在 37℃温度下孵育 30 分钟,然后置于冰槽里备用

1. 移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2. 加入 xx 微升反应液(Reagent D)

3. 加入 xx 微升底物液(Reagent E)

4. 上下倾倒数次,混匀

5. 在 37℃温度下孵育 3 分钟

6. 加入 20 微升上述预处理的待测样品

7. 上下倾倒数次,混匀(限定在 3 秒之内)

8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(15 分钟读数-0 分钟读数)

六、计算样品活性

4

(一) 样品活性(总活性或非特异活性)

(二) 样品特异活性

七、 酶标仪测定

(一) 样品总活性检测

1. 在 96 孔板上做好相应标记:样品背景(选择步骤)和样品活性

2. 分别移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到 96 孔板中的所有孔里

3. 分别加入 x 微升反应液(Reagent D)到所有孔里

4. 加入 xx 微升底物液(Reagent E)到样品活性孔里

5. 加入 xx 微升阴性液(Reagent F)到样品背景孔里

6. 轻轻摇动 96 孔板

7. 在 37℃温度下孵育 3 分钟

8. 分别加入 5 微升待测样品(50 微克总蛋白)到所有孔里(注意:样品须清澈)

9. 轻轻摇动 96 孔板

10.即刻放进酶标仪检测:0 分钟读数和 15 分钟读数

11.活性计算:

单位=微摩尔含硫多肽底物/分钟

(二) 样品非特异性活性检测

检测开始前,移取 5 微升待测样品(50 微克总蛋白)到新的 1.5 毫升离心管,加入 xx 微升专性液(Reagent

G),混匀后,在 37℃温度下孵育 30 分钟,然后置于冰槽里备用

1. 在 96 孔板上做好相应标记:待测样品

2. 移取 xx 微升缓冲液(Reagent C)到 96 孔板里

3. 加入 xx 微升反应液(Reagent D)

4. 加入 xx 微升底物液(Reagent E)

5. 轻轻摇动 96 孔板

6. 在 37℃温度下孵育 3 分钟

7. 加入 10 微升上述预处理的待测样品

8. 轻轻摇动 96 孔板

9. 即刻放进酶标仪检测:0 分钟读数和 15 分钟读数

10.活性计算:

单位=微摩尔含硫多肽底物/分钟

(三) 样品特异性活性计算

5

样品总活性-样品非特异活性 =样品特异活性

注意事项

1. 本产品为 20 次(10 个样本;比色皿)和 50 次(25 个样本;96 孔板)操作,包括背景对照

2. 操作时,须戴手套

3. 系统操作过程中,背景测定只需 1 次

4. 专性液(Reagent G)严禁反复冻融;有效期为 3 个月

5. 样品须澄清,至关重要

6. 样品准备要点如下:

a) 样品中避免使用 EDTA、EGTA 等二价阳离子鳌和剂

b) 样品中避免使用硫醇抑制剂(THIOL INHIBITOR)

c) 如果样品中的基质金属蛋白酶活性很低,可以使用活化剂(建议使用胶原酶潜酶活化剂(APMA)

-12197)

7. 建议使用比色皿测定

8. 如果试剂室温下不能融化,可以置于手心焐热融化即可

9. 样品须澄清,至关重要

10.加样后 3 秒内比色测定

11.测定值由低到高变化;测定可持续 15 分钟

12.比色测定后,比色皿须清洗

13.样本测定 15 分钟读数高于 0 分钟读数表明具有酶活性

14.待测样本为酶粗提样品,其蛋白浓度为 20 微克/10 微升;待测样本为细胞裂解悬液,其蛋白浓度为 100

微克/10 微升(本公司提供 BCA 蛋白质浓度定量试剂盒 30031.1)

15.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

16.如果检测基质金属蛋白酶 3 抑制剂,在加入底物液(Reagent E)前,37℃下孵育 30 分钟

17.如果检测部分或纯化酶样品中基质金属蛋白酶 3,则可以省去非特异活性检测步骤

18.基质金属蛋白酶 3 酶活性单位浓度定义:在 37℃温度下,pH 6.0 的情况下,每单位 UK356618 敏感性

酶在单位时间内(每分钟)水解 1 微摩尔的含硫多肽底物

19.本公司提供系列基质金属蛋白酶检测试剂产品

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测敏感


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